1、荧光量子PCR——实时追踪分子变化的精密工具qPCR，全称为荧光定量聚合酶链反应，它是一种通过荧光信号实时监测PCR扩增过程的技术。相较于常规PCR，qPCR不仅关注最终产物，更关注每个循环中的动态过程。原理与实时监控在PCR反应体系中，荧光基团如SYBR Green I或TaqMan探针被巧妙应用。
2、在qPCR过程中，良好的扩增曲线和溶解曲线至关重要，如清晰的指数期拐点、稳定且逐渐上升的荧光信号，以及平行的扩增曲线，这些都是评估实验质量的关键指标。常见问题解答 - 普通PCR与qPCR的差异在于，qPCR实时监测，提高了定量的准确性与重复性。
3、qPCR绝对定量有两种方法：（1）先获得一个拷贝数已知的参照基因，再获得靶标基因与该参照的比值，然后根据已知值获得检测样本的确切数目，从这个角度看绝对定量就是借助了“拷贝数已知”这一外力的相对定量。1990年，Gilliland等就描述了这一原理。
4、引物设计：精确的艺术 在qPCR实验中，引物作为PCR反应的起航者，其设计至关重要。理想的引物长度通常在18-21bp之间，保持45%-55%的GC含量，以确保稳定性。引物设计时务必避免互补序列，防止形成发夹或二聚体，并考虑到5端的化学修饰，不影响特异性。理想的退火温度应在60℃左右，确保反应效率和特异性。
1、qPCR基因表达分析技术，可以定量检测DNA或RNA样品中特定基因的拷贝数目。它基于聚合酶链反应PCR的原理，增加了实时荧光检测系统。qPCR的基本实验原理如下：样品处理：首先，需要从待检测的组织或细胞中提取目标DNA或RNA，并进行适当的纯化和浓缩处理，以确保获得高质量的核酸模板。
2、原理 DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。
3、原理 在指数阶段，PCR 产物的量在每个循环中大约增加一倍。然而，随着反应的进行，反应组分被消耗，最终一种或多种组分变得有限。此时，反应减慢并进入平台期。最初，荧光保持在背景水平，即使产物以指数方式累积，也无法检测到荧光的增加。最终，足够的扩增产物积累以产生可检测的荧光信号。
样本分配： 设计稀释梯度，确保样本均匀分配，减少加样误差。布板设计需精细，样品要同板，目的基因与内参基因分开，确保数据的一致性：布板策略： 样本体积、组分和稀释度要一致，确保数据的准确。接着，我们步入数据分析阶段：数据处理： 采用2-ΔΔCt法，借助GraphPad Prism 0进行相对定量分析。
- 普通PCR与qPCR的差异在于，qPCR实时监测，提高了定量的准确性与重复性。- 相对定量检测无需精确测量组织样本，而是通过内参基因校正表达差异。- miRNA的荧光定量PCR需特殊处理，如加尾和反转录步骤，以确保数据的可信度。
荧光定量PCR 实验步骤： ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。
荧光定量PCR的实验设计需要逻辑严密，包括目标样本的处理、对照设置、重复实验（包括生物性和技术重复）等，以降低误差。通过遵循MIQE指南，保证实验的透明度和可重复性。
操作步骤 样品准备：将待检测样品中的DNA或RNA提取出来，并进行纯化和浓缩。试剂制备：制备PCR反应体系所需的试剂，包括PCR反应缓冲液、酶、荧光探针等。PCR反应：将样品中的DNA或RNA与PCR反应体系中的试剂混合，进行PCR反应。反应过程中，荧光探针与目标分子结合，发出荧光信号。
